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关于WB实验的常见问题以及解决方案

时间:2017-03-13 10:50来源:上海极威生物科技有限公 作者:极威生物 点击:

关于WB实验的常见问题以及解决方案

 

问题1:免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?

答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。

 

问题2:做Western Blot时,同样的抗体免疫组化能做出,而Western Blot却不能?

答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做Western Blot和免疫组化。

问题3:Western Blot 中抗体的可以重复应用吗?

答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。

问题4:在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

问题5:要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。

问题6:一抗,二抗的比例是否重要?

答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。

问题7:转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好,为什么?

答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。

问题8:检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗?

答:可以。

问题9:如果是6×8转印膜,要加多少一抗?

答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。

问题10:上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果。

答:无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

 

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